Materna y/o post

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 8900 (2023) Citar este artículo

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Este estudio examinó los efectos de la suplementación materna y/o posdestete con Bacillus altitudinis sobre la microbiota en el calostro y las heces de las cerdas, y la digesta y las heces de las crías. Las cerdas (n = 12/grupo) se asignaron a: (1) dieta estándar (CON), o (2) CON suplementado con esporas probióticas de B. altitudinis (PRO) desde el día (d) 100 de gestación hasta el destete (d26 de lactancia). ). Al destete, las crías se asignaron a CON o PRO durante 28 días, lo que resultó en: (1) CON/CON, (2) CON/PRO, (3) PRO/CON y (4) PRO/PRO, después de lo cual todos recibieron CON . Se recogieron muestras de cerdas y crías seleccionadas (n = 10/grupo) para la secuenciación del gen 16S rRNA. Rothia fue más abundante en el calostro de las cerdas PRO. Las heces de las cerdas no se vieron afectadas, pero se identificaron diferencias en las heces y la digesta de las crías. La mayoría estaba en la digesta ileal entre PRO/CON y CON/CON en el día 8 posterior al destete; es decir, Bacteroidota, Alloprevotella, Prevotella, Prevotellaceae, Turicibacter, Catenibacterium y Blautia fueron más abundantes en PRO/CON, con Firmicutes y Blautia más abundantes en PRO/PRO en comparación con CON/CON. Lactobacillus fue más abundante en heces PRO/CON en d118 post-destete. Este aumento en la abundancia de fermentadores de polisacáridos (Prevotella, Alloprevotella, Prevotellaceae), productores de butirato (Blautia) y Lactobacillus probablemente contribuyó a las mejoras reportadas anteriormente en el rendimiento del crecimiento. En general, la suplementación con probióticos materna, en lugar de después del destete, tuvo el mayor impacto en la microbiota intestinal.

En la producción comercial de cerdos, el destete es un período desafiante asociado con impactos negativos en el crecimiento y la salud de los cerdos1. Durante este período, los lechones están expuestos a factores estresantes psicológicos, ambientales y nutricionales2,3, que a menudo dan como resultado una mayor susceptibilidad a la diarrea posdestete (PWD) y un rendimiento de crecimiento reducido2. Los antibióticos y el óxido de zinc (ZnO) se agregan con frecuencia a la dieta de los lechones destetados para prevenir estos problemas. Sin embargo, el uso de antibióticos para estimular el crecimiento se prohibió en la UE en 2006 debido al aumento de la resistencia a los antimicrobianos (Reglamento de la CE nº 1831/2003). Otras restricciones, incluida la prohibición del uso preventivo de antibióticos en grupos de animales y a través de alimentos medicados, y la prohibición del uso de dosis farmacológicas de ZnO, entraron en vigor en la UE en enero y junio de 2022, respectivamente (Reglamento [EU ] 2019/6 sobre Medicamentos Veterinarios y Reglamento [UE] 2019/4 sobre Piensos Medicados). Como resultado, existe una necesidad urgente de desarrollar estrategias dietéticas alternativas adecuadas para mantener la productividad y el bienestar de los cerdos durante la transición al destete, siendo los probióticos un enfoque prometedor.

Los probióticos se definen como 'microorganismos vivos que, cuando se administran en cantidades adecuadas, confieren un beneficio para la salud del huésped'4. Bacillus spp. son formadores de esporas y, como resultado, ofrecen algunas ventajas sobre otros microorganismos probióticos comúnmente utilizados en el ganado, como Lactobacillus, Enterococcus y Saccharomyces. La capacidad de formar endosporas permite que Bacillus spp. mayor resistencia a las duras condiciones encontradas durante la formulación del producto y las actividades de procesamiento de alimentos, como el secado por aspersión y la granulación (por ejemplo, baja humedad y altas temperaturas), mejorando así la viabilidad y la vida útil5. Además, los estudios han demostrado que las esporas de Bacillus pueden resistir las condiciones ácidas del estómago, lo que facilita el tránsito a través del tracto gastrointestinal (GIT)6,7.

Estudios como los realizados por Dou et al.8, que encontraron que la microbiota fecal de los cerdos que desarrollaron PWD difería de la de los cerdos sanos a partir de los 7 días de edad, demuestran la importancia de la microbiota en los primeros años de vida. Esto ha llevado al pensamiento actual de que la manipulación de la microbiota en las primeras etapas de la vida debería tener el mayor impacto9. La suplementación materna con aditivos alimentarios es una estrategia que potencialmente puede resultar en efectos beneficiosos en la descendencia a una edad más temprana de lo que se puede lograr con la suplementación directa. Utilizando esta estrategia de suplementación materna, los probióticos a base de Bacillus han demostrado una variedad de beneficios que incluyen la reducción de patógenos entéricos en lechones lactantes10,11, tasas de crecimiento mejoradas de los lechones10,11,12 y una incidencia reducida de diarrea12. Recientemente, nuestro grupo de investigación ha demostrado beneficios de crecimiento de por vida en la descendencia de cerdas suplementadas con esporas de Bacillus altitudinis WIT588 durante la gestación tardía y la lactancia13. Se observó un aumento del peso corporal en las crías de las cerdas suplementadas con Bacillus durante el período de finalización, lo que finalmente condujo a un aumento del peso de la canal y del porcentaje de muertes en el sacrificio13. Los mecanismos de acción propuestos incluyen una mejor calidad del calostro en las cerdas y una mayor capacidad de absorción del intestino delgado en las crías durante el período crítico temprano posterior al destete (PW), lo que lleva a una mejora observada en la eficiencia de conversión alimenticia13. La modulación de la microbiota intestinal también puede ser un factor, considerando su contribución a la salud intestinal y la utilización de nutrientes14. Así, el objetivo de este estudio fue determinar, por primera vez, si la suplementación materna y/o PW con esporas de B. altitudinis WIT588 influye en la composición y/o diversidad de la microbiota en heces y calostro de cerdas y en la digesta y heces, en varios momentos desde el final de la gestación hasta el final del período de finalización.

Para fines de simplificación, los grupos de tratamiento de cerdas se abrevian en el resto de la sección de resultados de la siguiente manera: CON, cerdas alimentadas con una dieta de control; y PRO, cerdas alimentadas con una dieta suplementada con probióticos. De manera similar, los grupos de tratamiento de crías se abrevian de la siguiente manera: CON/CON, lechones destetados de cerdas de control, alimentados con una dieta de control; CON/PRO, lechones destetados de cerdas control, alimentados con una dieta suplementada con probióticos; PRO/CON, lechones destetados de cerdas suplementadas con probióticos, alimentados con una dieta de control; y PRO/PRO, lechones destetados de cerdas suplementadas con probióticos, alimentadas con una dieta suplementada con probióticos.

El efecto del tratamiento sobre la diversidad microbiana del calostro se presenta en la Fig. 1a. La diversidad α de Shannon, que es una medida de la riqueza y uniformidad de las especies, fue menor en el calostro de las cerdas PRO en comparación con las cerdas CON (P < 0,05). En relación con la diversidad β en el calostro, no hubo agrupación basada en el tratamiento (Fig. S1 complementaria).

El efecto del tratamiento de las cerdas en la diversidad α de Shannon (A) y la abundancia relativa media de Actinobacteriota (B) y Rothia (C) en el calostro de las cerdas. Tratamiento materno: control CON y probiótico PRO. Las diferencias significativas entre tratamientos dentro de cada punto de muestreo se indican como *P < 0,05.

Se identificaron un total de 15 filos, 82 familias y 190 géneros en las muestras de calostro. Firmicutes y Actinobacteriota fueron los filos predominantes (Fig. S2a complementaria), mientras que los géneros predominantes fueron Staphylococcus, Corynebacterium y Rothia (Fig. S2b complementaria). Los taxones diferencialmente abundantes se presentan en la Tabla complementaria S1 y la abundancia relativa media de filos y géneros bacterianos se presentan en la Fig. complementaria S2a y S2b, respectivamente. A nivel de filo, Actinobacteriota fue más abundante en el calostro de las cerdas PRO en comparación con las cerdas CON (P < 0,05; Fig. 1b). A nivel de género, el calostro de las cerdas PRO tuvo una mayor abundancia de Rothia (P < 0,05; Fig. 1c) y Globicatella (P < 0,01), y una menor abundancia de Vagococcus (P < 0,01) en comparación con las cerdas CON. Una búsqueda BLAST de la secuencia asignada al género Rothia dio como resultado varias coincidencias, incluidas R. marina, R. endophytica, R. nasimurium y R. mucilaginosa.

No hubo efecto del tratamiento en la diversidad α de Shannon en ningún punto de muestreo en las muestras fecales de las cerdas (Fig. S3a complementaria). En general, la diversidad microbiana pareció disminuir durante el período de lactancia, independientemente del tratamiento de las cerdas. La diversidad β de la microbiota fecal se representa mediante un gráfico de escalado multidimensional (MDS) UniFrac no ponderado (Fig. S3b complementaria). Si bien las muestras no se agrupan según el tratamiento (control o probiótico), sí se separan según el momento del muestreo, con las muestras recolectadas durante la gestación y el parto agrupadas por separado de las recolectadas durante la lactancia (día (d) 13 de lactancia y destete) .

Se identificaron un total de 15 filos, 73 familias y 157 géneros en las heces de las cerdas en todos los puntos de muestreo. Firmicutes y Bacteroidota fueron los filos predominantes encontrados en todos los puntos de muestreo (Figura complementaria S4) y Spirochaetaceae, Prevotellaceae, Oscillospiraceae y Rikenellaceae fueron las familias predominantes (datos no mostrados). No se encontraron diferencias debidas a la suplementación con probióticos a nivel de filo, familia o género en las muestras fecales de cerdas en ningún punto de muestreo.

No hubo diferencias en la diversidad α en las muestras fecales de crías en los puntos de tiempo de muestreo (P> 0.05; Fig. S5 complementaria). Hubo un efecto del tratamiento sobre la diversidad α microbiana en el íleon (Fig. 2a), con una reducción de la diversidad de Shannon en el grupo PRO/PRO en comparación con el grupo CON/CON (P < 0,05) y los grupos PRO/CON (P = 0.05), aunque esto último fue una tendencia. No hubo diferencias relacionadas con el tratamiento en la diversidad microbiana en el ciego o el recto.

Efecto del tratamiento materno y posterior al destete en la diversidad α de Shannon en la digesta de las crías (A) y en las distancias UniFrac ponderadas (diversidad β) de la microbiota en las heces y la digesta de las crías en todos los puntos de muestreo (B). Los tratamientos son los siguientes (tratamiento materno/tratamiento post-destete): CON/CON, CON/PRO, PRO/CON y PRO/PRO; donde CON es control y PRO es probiótico. Las diferencias significativas entre tratamientos dentro de cada punto de muestreo se indican como *P < 0,05 y †0,05 < P < 0,10. Los colores indican el tipo de muestra y el punto temporal en el que se tomaron muestras de los cerdos (las muestras recogidas en el momento del destete, d27_PW, d56_PW y d118_PW son muestras fecales). NMDS, escalado multidimensional no métrico.

La diversidad β de la microbiota fecal y digesta se representa mediante un gráfico MDS no métrico (nMDS) UniFrac ponderado para evaluar las diferencias entre los grupos de tratamiento (Fig. 2b). En general, hubo varios conglomerados según el punto de muestreo/tipo de muestra. Curiosamente, las muestras fecales recolectadas el día 13 de lactancia se agruparon por separado con las muestras fecales recolectadas el día del destete (día 26 de lactancia). Estos dos grupos también se agruparon por separado de las muestras recolectadas PW. Las muestras fecales/digestivas recolectadas en d8, d27, d56 y d118 PW no parecen segregarse, con la excepción de las muestras de digesta ileal de d8 PW, que se agrupan por separado con las otras muestras/puntos de tiempo de muestreo. El ANOVA permutacional mostró que la métrica UniFrac ponderada para la digestión ileal en d8 PW difería de la métrica UniFrac ponderada para las otras muestras fecales/digestivas (P < 0,05). De manera similar, la métrica UniFrac ponderada tendió a diferir entre las heces al destete y las otras muestras fecales/digestivas (P = 0,08) y entre el ciego en d8 PW y las otras muestras fecales/digestas (P = 0,08).

Se identificaron un total de 16 phyla, 99 familias y 248 géneros en muestras de heces y digesta de crías en todos los puntos de muestreo, siendo Firmicutes y Bacteroidota los phyla predominantes. Hasta e incluyendo d8 PW, el tercer filo más abundante fue Proteobacteria, que, como se esperaba, aumentó en el período PW temprano (d8 PW) y disminuyó a partir de entonces. Todas las diferencias identificadas entre los grupos de tratamiento antes del destete [lactancia d13 y d26 (destete)] se presentan en la Tabla complementaria S2 y todas las diferencias relacionadas con el tratamiento en las muestras recolectadas PW se presentan en la Tabla complementaria S3. Los phyla y géneros diferencialmente abundantes en las heces de las crías al destete se presentan en la Fig. 3. La abundancia relativa media (%) de todos los phyla bacterianos y los phyla diferencialmente abundantes seleccionados en la digestión ileal de las crías en d8 PW se presentan en la Fig. 4 Los 20 géneros más abundantes y géneros diferencialmente abundantes seleccionados en el íleon en d8 PW se presentan en las Figs. 5 y 6, respectivamente. Los 20 géneros más abundantes en las heces de las crías y la abundancia relativa media de Lactobacillus en d118 PW se presentan en la Fig. 7.

El efecto del tratamiento materno sobre la abundancia relativa media (%) de Synergistota (A), Alloprevotella (B), Rikenellaceae dgA-11 grupo intestinal (C) y Lachnospiraceae NK4A136 grupo (D) en las heces de las crías al destete (día 26). lactancia). Tratamiento materno: CON control, PRO probiótico. Las diferencias significativas entre tratamientos se indican como *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001; ****P < 0,0001.

El efecto del tratamiento materno y posterior al destete sobre la abundancia relativa media (%) de filos bacterianos (A), Firmicutes (B), Bacteroidota (C) y Spirochaetota (D) en el íleon de la descendencia el día 8 posterior al destete. Los tratamientos son los siguientes (tratamiento materno/tratamiento post-destete): CON/CON, CON/PRO, PRO/CON y PRO/PRO; donde CON es control y PRO es probiótico. Las diferencias significativas entre tratamientos se indican como *P < 0,05, **P < 0,01.

El efecto del tratamiento materno y posterior al destete sobre la abundancia relativa media de los 20 géneros más abundantes en el íleon de las crías el día 8 posterior al destete. Los tratamientos son los siguientes (tratamiento materno/tratamiento post-destete): CON/CON, CON/PRO, PRO/CON y PRO/PRO; donde CON es control y PRO es probiótico.

El efecto del tratamiento materno y posterior al destete sobre las abundancias relativas medias de Bacillus (A), Catenibacterium (B), Blautia (C), grupo intestinal Rikenellaceae RC9 (D), Prevotella (E) y grupo Prevotellaceae NK3B3A (F) en el íleon el día 8 después del destete. Los tratamientos son los siguientes (tratamiento materno/tratamiento post-destete): CON/CON, CON/PRO, PRO/CON y PRO/PRO; donde CON es control y PRO es probiótico. Las diferencias significativas entre tratamientos se indican como *P < 0,05, **P < 0,01.

El efecto del tratamiento materno y posdestete sobre las abundancias relativas medias (%) de los 20 géneros más abundantes (A) y Lactobacillus spp. (B) en las heces de las crías el día 118 después del destete. Los tratamientos son los siguientes (tratamiento materno/tratamiento posterior al destete): CON/CON, CON/PRO, PRO/CON y PRO/PRO; donde CON es control y PRO es probiótico. Las diferencias significativas entre tratamientos se indican como *P < 0,05, **P < 0,01.

No hubo diferencias en la abundancia de taxones por encima del 1% de abundancia relativa predestete. Al destete (día 26 de lactación), el filo Synergistota fue menos abundante en las heces de los cerdos destetados de las cerdas PRO en comparación con los cerdos destetados de las cerdas CON (P < 0,05; Fig. 3a). A nivel de género, Alloprevotella (P < 0.05; Fig. 3b) y el grupo intestinal Rikenellaceae dgA-11 (P < 0.001; Fig. 3c) fueron menos abundantes, y Lachnospiraceae NK4A136 (P < 0.05; Fig. 3d) fue más abundante en cerdos destetados de cerdas PRO en comparación con cerdos destetados de cerdas CON.

La abundancia relativa media de todos los filos bacterianos en el íleon se presenta en la Fig. 4a. Se identificaron seis filos diferencialmente abundantes (Tabla complementaria S3). Actinobacteriota fue menos abundante en los grupos CON/PRO y PRO/CON en comparación con el grupo CON/CON (P < 0,01; Fig. 4a). Firmicutes fue más abundante en el grupo PRO/PRO en comparación con el grupo CON/CON (P < 0,05; Fig. 4a,b). Bacteroidota fue más abundante en el grupo PRO/CON en comparación con los grupos CON/CON y PRO/PRO (P < 0,01), y más abundante en el grupo CON/PRO en comparación con el grupo PRO/PRO (P < 0,01; Fig. 4a,c). La espiroqueta fue más abundante en el grupo PRO/CON en comparación con el grupo CON/CON y los grupos PRO/PRO (P < 0,05 y P < 0,01, respectivamente; Fig. 4a, d).

Se identificaron cincuenta y tres diferencias relacionadas con el tratamiento a nivel de género (Tabla complementaria S3). Para fines de simplificación, aquí solo se reportan diferencias significativas para géneros con una abundancia relativa > 1% con la excepción del género Bacillus. La abundancia relativa media de los 20 géneros más abundantes se presenta en la Fig. 5. Chryseobacterium fue menos abundante en los grupos CON/PRO, PRO/CON y PRO/PRO en comparación con el grupo CON/CON (P < 0,01, P < 0,05 y P < 0,001, respectivamente; Tabla complementaria S3). Alloprevotella fue más abundante en el grupo PRO/CON en comparación con los grupos CON/CON y PRO/PRO (P = 0,05 y P < 0,05, respectivamente; Fig. 5). Turicibacter fue más abundante en el grupo PRO/CON en comparación con el grupo CON/CON (P < 0,01; Fig. 5). Pelistega fue menos abundante en el grupo CON/PRO en comparación con el grupo CON/CON (P < 0,05; Fig. 5). Rothia fue menos abundante en los grupos PRO/CON y PRO/PRO en comparación con el grupo CON/CON (P < 0,05; Fig. 5). Terrisporobacter y Clostridium sensu stricto 1 fueron más abundantes en el grupo PRO/PRO en comparación con el grupo CON/CON (P < 0,05; Fig. 5).

Escherichia/Shigella fue más abundante en los grupos CON/PRO, PRO/CON y PRO/PRO en comparación con el grupo CON/CON (P < 0,01; Fig. 5). Una búsqueda BLAST de la secuencia asignada al género Escherichia/Shigella dio como resultado varias coincidencias, incluidas numerosas cepas de E. coli, S. sonnei, S. flexneri, E. fergusonii y Escherichia spp.

Bacillus fue más abundante en los grupos CON/PRO y PRO/PRO en comparación con el grupo CON/CON (P < 0,001 y P < 0,01, respectivamente; Fig. 6a). Catenibacterium fue más abundante en el grupo PRO/CON en comparación con el grupo CON/CON (P < 0,05; Fig. 6b). Blautia fue más abundante en los grupos PRO/CON y PRO/PRO en comparación con el grupo CON/CON (P < 0,05 y P < 0,01, respectivamente; Fig. 6c). El grupo intestinal Rikenellaceae RC9 fue más abundante en los grupos CON / PRO y PRO / CON en comparación con el grupo CON / CON (P <0.05; Fig. 6d). Prevotella (P < 0.01; Fig. 6e) fue más abundante en el grupo PRO/CON en comparación con el grupo CON/CON. Prevotellaceae NK3B31 fue más abundante en el grupo PRO/CON en comparación con los grupos CON/CON y PRO/PRO (P < 0,01 y P < 0,05) y más abundante en el grupo CON/PRO en comparación con el grupo PRO/PRO (P < 0,01; figura 6f).

Se identificaron tres géneros diferencialmente abundantes en el ciego en d8 PW (Tabla complementaria S3). El treponema fue más abundante en el grupo PRO/CON en comparación con el grupo CON/CON (P < 0,05).

Se identificaron dos filos diferencialmente abundantes en el recto en d8 PW (Tabla complementaria S3). Campylobacterota fue más abundante en el grupo CON/PRO en comparación con los grupos CON/CON, PRO/CON y PRO/PRO (P < 0,01).

Se identificaron tres diferencias a nivel de filo y dos diferencias a nivel de género en las muestras fecales recolectadas en d27 PW (Tabla complementaria S3). El filo Firmicutes fue menos abundante en el grupo CON/PRO en comparación con los grupos PRO/CON y PRO/PRO (P < 0,05). El género Prevotellaceae UCG 001 fue más abundante en los grupos PRO/CON y PRO/PRO en comparación con el grupo CON/CON (P < 0,01). El género del grupo Lachnospiraceae ND3007 fue menos abundante en el grupo PRO/PRO en comparación con los grupos CON/CON y CON/PRO (P < 0,001 y P < 0,05, respectivamente).

Hubo un género diferencialmente abundante en las muestras fecales recolectadas en d56 PW (Tabla complementaria S3); Alloprevotella fue menos abundante en el grupo PRO/PRO en comparación con el grupo PRO/CON (P < 0,05).

Se identificaron ocho géneros diferencialmente abundantes en las muestras fecales recolectadas en d118 PW (Tabla complementaria S3). Lactobacillus (Fig. 7a,b) fue más abundante en el grupo PRO/CON en comparación con los grupos CON/CON y CON/PRO (P < 0,01). El grupo Succinivibrio y Lachnospiraceae NK4A136 fue menos abundante en el grupo PRO/CON en comparación con el grupo CON/PRO (P < 0,05).

El efecto del tratamiento sobre la concentración de SCFA en el íleon se presenta en la Tabla 1. No hubo efecto del tratamiento sobre la concentración de SCFA totales, ácidos grasos volátiles totales (AGV), ácidos grasos de cadena ramificada totales (BCFA), ácido láctico o ácido propiónico en la digesta ileal. Sin embargo, la concentración de ácido acético fue mayor (5,62 frente a 2,93 mmol/kg, SEM 0,912, P < 0,05) y la concentración de ácido valérico tendió a ser menor (0,021 frente a 0,042 mmol/kg, SEM 0,006, P = 0,099) en la digesta ileal de los cerdos que recibieron el probiótico PW en comparación con los cerdos que no recibieron el suplemento. También hubo una tendencia a un efecto del tratamiento materno sobre la concentración de ácido butírico, con cerdos destetados de cerdas suplementadas con probióticos que tenían una concentración más alta en comparación con los destetados de cerdas no suplementadas (0,174 frente a 0,100 mmol/kg, SEM 0,030, P = 0,07).

Según el conocimiento de los autores, este es el primer estudio que examina los efectos de la suplementación materna con un probiótico basado en Bacillus en la composición microbiana del calostro y las heces de la cerda y la digesta y las heces de las crías desde la lactancia hasta el período de finalización. Los resultados muestran que la suplementación materna con probióticos influye en la composición microbiana del calostro de las cerdas pero no en las heces de las cerdas. La suplementación, ya sea materna o directamente PW, también influyó en la composición microbiana de la digesta y las heces PW de las crías. Sin embargo, la mayoría de los efectos observados se observaron en cerdos destetados de cerdas suplementadas con probióticos, observándose una serie de efectos potencialmente beneficiosos en la digesta ileal de los cerdos del grupo PRO/CON el día 8 PW y en las heces de este grupo el día 118 PW . Bacillus spp. se detectaron en la digesta ileal de lechones tratados tanto de forma materna como directamente en d8 PW, aunque con una abundancia < 1%. La abundancia de Bacillus fue mayor en el íleon de los cerdos que recibieron el probiótico en el momento del muestreo (0,87 % y 0,39 % en los grupos CON/PRO y PRO/PRO, respectivamente, frente a 0,01 % en el grupo PRO/CON). Este hallazgo está de acuerdo con los recuentos de la cepa administrada, por lo que el probiótico se detectó en la digestión ileal de los grupos CON/PRO y PRO/PRO pero no en el grupo PRO/CON en d8 PW, como se informó anteriormente en nuestra publicación paralela13. De manera similar, cuando se administró una combinación de Bacillus subtilis y B. licheniformis a cerdos en crecimiento, Kaewtapee et al.15 notaron que las unidades taxonómicas operativas (OTU, por sus siglas en inglés) correspondientes al género Bacillus aparecían con < 1 % de abundancia en el íleon de cerdos suplementados y no alimentados. - cerdos suplementados; sin embargo, no encontraron la diferencia en la abundancia entre los animales de tratamiento y de control como lo hacemos nosotros aquí. Esos autores sugirieron que la detección de Bacillus dentro del íleon indica que pueden germinar en el TGI de los mamíferos, aunque a un ritmo bajo y, por lo tanto, es posible que no puedan persistir15,16. Juntos, estos hallazgos sugieren que los probióticos de Bacillus no predominan dentro de la microbiota del intestino delgado, pero que las esporas administradas parecen germinar, ya que se detectan mediante métodos basados ​​en el ADN, lo que sugiere la presencia de células vegetativas, que son más susceptibles a la extracción de ADN. que las esporas17.

Como se describió anteriormente, B. altitudinis WIT588 se detectó en las heces de las cerdas suplementadas en comparación con las no suplementadas y la presencia del probiótico en las heces es el modo probable de transmisión del probiótico entre la cerda y su descendencia13. Sin embargo, el análisis de secuenciación del gen 16S rRNA realizado aquí no encontró ninguna diferencia en la diversidad o composición bacteriana fecal de las cerdas. Curiosamente, el microbioma fecal de la cerda durante la gestación y el parto difería del observado durante la lactancia. Esto está de acuerdo con los hallazgos de estudios previos18,19,20 y probablemente se deba a cambios dietéticos, metabólicos y hormonales durante la lactancia.

Aunque la diversidad y la composición bacteriana fecal de las cerdas no se vieron afectadas por la suplementación con probióticos, ambos parámetros se alteraron en el calostro de las cerdas suplementadas con probióticos. Esto puede deberse a la menor diversidad bacteriana en el calostro en comparación con las heces, ya que una mayor diversidad de la comunidad se asocia con una mayor resistencia a las alteraciones en la composición21,22. La suplementación con probióticos condujo a una reducción de la diversidad bacteriana en el calostro. Si bien una reducción en la diversidad dentro del microbioma intestinal se considera indeseable, se sabe poco sobre los efectos de la reducción de la diversidad microbiana en el calostro, que intrínsecamente tiene una comunidad microbiana más pequeña con menos funciones. Por lo tanto, puede que no sea necesario un alto nivel de diversidad microbiana dentro del microbioma del calostro. Además, la pérdida de diversidad no siempre equivale a una pérdida de la función microbiana. Las comunidades microbianas del suelo, por ejemplo, pueden recuperar su función incluso si la diversidad microbiana sigue siendo reducida21. Es importante destacar que la reducción de la diversidad bacteriana en el calostro observada en el presente estudio debido a la administración de probióticos no se asoció con ningún efecto negativo en el crecimiento o la salud de las crías en los períodos previos o posteriores al destete, como se informó en un estudio paralelo sobre el rendimiento del crecimiento ya publicado13 .

Aunque hay pocos estudios disponibles para la comparación, los filos predominantes (Firmicutes y Actinobacteria) y géneros (Staphylococcus, Corynebacterium y Rothia) identificados en el calostro en este estudio están en línea con las observaciones previas para el calostro y la leche de las cerdas23. La mayor abundancia relativa del filo Actinobacteria en el calostro de las cerdas suplementadas con probióticos en comparación con el control, probablemente se debió a la mayor abundancia del género Rothia. Rothia spp. son comensales orales, cutáneos e intestinales comunes de humanos, cerdos y roedores24,25,26 y se han encontrado previamente en la leche de cerdos, humanos, cabras y ratas24,25. Como Rothia spp. se encuentran en la cavidad oral y en la piel, es posible que se hayan originado en las tetillas de la cerda o en la boca de los lechones27,28; sin embargo, los pezones se limpiaron antes del muestreo para evitar la contaminación de la piel. La secuencia identificada como diferencialmente abundante en el calostro coincide con varias Rothia spp., clasificadas como ambientales (R. marina y endophytica), pero también especies animales (R. nasimurium) y una especie considerada patógena oportunista en humanos (R. mucilaginosa). Las diferencias observadas en la composición microbiana del calostro pueden deberse a la composición de nutrientes alterada del calostro de las cerdas suplementadas con probióticos, que tenía una mayor concentración de proteína y una menor concentración de lactosa que el calostro de las cerdas no suplementadas, como se informó anteriormente en nuestra publicación paralela13. Las alteraciones en la composición del calostro pueden ser causadas por mejoras en la digestión y absorción de nutrientes, asociadas con una mejor salud intestinal y/o actividad enzimática en el TGI de la cerda como resultado de la suplementación con probióticos29. Rothia spp. puede fermentar carbohidratos y proteínas30,31 y un estudio encontró que el crecimiento del comensal oral Rothia mucilaginosa se redujo cuando el medio de cultivo se complementó con lactosa en comparación con glucosa o sacarosa30. Por lo tanto, la menor abundancia de Rothia en el calostro de las cerdas de control puede estar asociada con la mayor concentración de lactosa en su calostro. Otra posible explicación de la composición microbiana alterada en el calostro de las cerdas suplementadas con probióticos es la translocación bacteriana desde el TGI de la cerda a la glándula mamaria a través del torrente sanguíneo. Esto se conoce como la vía enteromamaria. Varios estudios en cerdos, vacas, humanos y ratones han proporcionado evidencia para respaldar esta teoría32,33,34. Sin embargo, para ver los cambios en la composición del calostro a través de esta ruta, primero sería necesario afectar la microbiota intestinal de la cerda y no podemos determinarlo, ya que no fue posible tomar muestras intestinales de las cerdas, es decir, todo lo que podemos concluir es que la microbiota fecal no se vio afectada. No obstante, es probable que la microbiota intestinal de las cerdas haya sido modulada por el probiótico, ya que fue dentro de la microbiota del íleon donde se observó el mayor impacto en la descendencia.

Se esperaba que la suplementación materna con probióticos influyera en la composición de la microbiota de las crías mientras aún estaban amamantando a la cerda y en el período de VP temprano. Sin embargo, la mayoría de los efectos se detectaron en la digesta ileal en d8 PW y en muestras fecales recolectadas PW y en el período de acabado. Hay muy pocos estudios en los que se haya suplementado a las cerdas con probióticos a base de Bacillus y, de estos, aún menos han medido los efectos sobre la microbiota de la descendencia. Baker et al.10 encontraron alteraciones beneficiosas en la microbiota ileal y colónica de la descendencia en el día 3 y el día 10 de la lactancia después de la suplementación materna con Bacillus, utilizando la técnica del polimorfismo de longitud de fragmento de restricción terminal, ahora obsoleta. Teniendo en cuenta la gran cantidad de diferencias en la abundancia de bacterias identificadas en la digesta ileal en d8 PW en el presente estudio, es posible que también se hayan detectado diferencias allí durante el período de lactancia. Sin embargo, no se recogieron contenidos intestinales de las crías durante la lactancia.

Los cambios observados en la microbiota intestinal de las crías de cerdas suplementadas con probióticos durante el período PW temprano pueden estar relacionados con el microbioma alterado del calostro, ya que se ha demostrado que la microbiota intestinal de los cerdos en la vida temprana está fuertemente influenciada por la microbiota de la leche materna35 . Al destete, los cerdos destetados de las cerdas suplementadas con probióticos tenían una mayor abundancia de Lachnospiraceae, una familia asociada con la fermentación de polisacáridos vegetales y la producción de ácido butírico36. El ácido butírico es la fuente de energía preferencial de los colonocitos37. Puede mejorar la salud intestinal al facilitar la absorción de agua, sodio y potasio, regular la expresión génica al inhibir la expresión de histonas desacetilasas, mejorar la expresión de péptidos de defensa del huésped y a través de su actividad antibacteriana38,39. Por lo tanto, la mayor abundancia de Lachnospiraceae en las crías de cerdas suplementadas con probióticos puede tener beneficios en términos de integridad intestinal y absorción de nutrientes. Esto puede ayudar a explicar la modulación positiva previamente informada de los parámetros histológicos del intestino delgado en el día 8 PW, la mejora de la eficiencia alimenticia observada durante los primeros 14 días PW y las mejoras posteriores en el crecimiento de las crías de cerdas suplementadas con probióticos13. Aunque los VFA no se midieron al destete, hubo una tendencia a un aumento en el ácido butírico en la digesta ileal recolectada en d8 PW en cerdos destetados de las cerdas suplementadas con probióticos. Esto puede haber contribuido a la mejora de la altura de las vellosidades en el duodeno y el íleon de las crías destetadas de las cerdas suplementadas con probióticos observadas en el día 8 PW13. Si bien el ácido butírico es la fuente de energía preferencial de los colonocitos, también puede estimular la proliferación y el crecimiento celular en el intestino delgado (según lo revisado por Liu40). La suplementación oral con diversas formas de butirato en lechones destetados mejoró la morfología del intestino delgado41,42,43,44,45, aumentó la actividad de las enzimas digestivas44 y redujo la incidencia de diarrea43. El ácido acético se elevó en la digesta ileal de los lechones que recibieron el probiótico PW. El ácido acético puede ser metabolizado por los tejidos periféricos y proporcionar energía al huésped46. Por lo tanto, este aumento de la concentración ileal de ácido acético podría contribuir a mejorar la recuperación de energía de la dieta, aunque no se observaron mejoras en el crecimiento de estos animales en nuestro estudio paralelo13.

La mayoría de los efectos mediados por probióticos se encontraron en la microbiota ileal de las crías en el día 8 PW, y la mayoría de las diferencias ocurrieron entre los lechones destetados de cerdas suplementadas con probióticos y a los que se les ofreció la dieta sin suplementos PW (PRO/CON) y los cerdos destetados de cerdas no suplementadas y a los que se les ofreció los grupos PW (CON/CON) de la dieta no suplementada. En este momento, la microbiota puede ser más plástica como consecuencia de las alteraciones provocadas por el cambio de dieta al destete47. La abundancia de Bacteroidota fue mayor en el grupo PRO/CON en comparación con el grupo CON/CON. Se ha demostrado previamente que la abundancia de este filo aumenta el PW48 y está asociado con los cambios en la dieta del PW. En el presente estudio, su mayor abundancia probablemente esté relacionada con la mayor abundancia de miembros de la familia Prevotellaceae (Prevotella, Alloprevotella y Prevotellaceae) en el grupo PRO/CON. Los miembros de esta familia, por ejemplo Prevotella spp., pueden descomponer los polisacáridos en la pared celular de los cereales usando xilanasas, mananasas y β-glucanasas49,50,51 y, por lo tanto, están involucrados en la fermentación de carbohidratos no digeridos con la producción resultante de AGV, contribuyendo así a una mayor recolección de energía para el huésped. Por lo tanto, esta mayor abundancia de miembros de la familia Prevotellaceae puede ayudar a explicar la mejora en la eficiencia alimenticia durante los primeros 14 días PW en las crías de las cerdas suplementadas con probióticos y las subsiguientes mejoras en el crecimiento de estos animales informados anteriormente en nuestra publicación paralela13. Los datos sobre el papel de Prevotella en el intestino del cerdo son contradictorios, pero una revisión reciente concluyó que los estudios que muestran asociaciones positivas con la eficiencia alimenticia y el crecimiento superan en número a los que muestran correlaciones negativas14. Los géneros Blautia y Turicibacter, que pertenecen al filo Firmicutes, también aumentaron en el grupo PRO/CON en comparación con el grupo CON/CON. Blautia también participa en la fermentación de carbohidratos y, recientemente, Turicibacter mostró una correlación positiva con el peso corporal en cerdos52. Blautia es un miembro de la familia Lachnospiraceae que produce ácido butírico y se cree que está involucrado en el alivio de enfermedades inflamatorias y metabólicas y posee actividad antibacteriana debido a la producción de bacteriocinas53,54. Blautia también se ha asociado positivamente con la eficiencia alimenticia en cerdos55. Varios otros géneros asociados con la producción de ácido butírico, como Ruminococcus y Roseburia, también aumentaron en la digesta ileal del grupo PRO/CON. Los géneros productores de ácido butírico a menudo usan acetato en la vía butiril-coenzima A: acetato CoA-transferasa55,56. Las Prevotella spp., que también aumentaron en abundancia y son productoras de acetato, pueden facilitar este proceso51,57,58. Por lo tanto, el aumento combinado de los productores de acetato y ácido butírico en la digesta ileal del grupo PRO/CON puede haber contribuido a la mayor concentración de ácido butírico en la digesta ileal de los cerdos destetados de las cerdas suplementadas con probióticos. Curiosamente, en d118 PW Lactobacillus fue más abundante en el grupo PRO/CON en comparación con los grupos CON/CON y CON/PRO. Lactobacillus spp. se consideran beneficiosos y se cree que mejoran la salud intestinal a través de la exclusión competitiva de patógenos, la actividad antioxidante y la inmunomodulación59. Además, Lactobacillus se enriquece constantemente en el intestino grueso de los cerdos con mayor eficiencia alimentaria14. Otros estudios en los que los probióticos Bacillus se han suplementado directamente en cerdos destetados y en finalización también han mostrado un aumento de Lactobacillus60,61.

La abundancia de firmicutes aumentó en el grupo PRO/PRO en comparación con el grupo CON/CON en la digesta ileal en el día 8 PW. Esto puede considerarse beneficioso, ya que se cree que este filo contribuye a la producción de AGV y la regulación de las respuestas inmunitarias sistémicas, lo que contribuye al ahorro de energía, la inhibición de patógenos oportunistas y la protección contra la inflamación62. Dentro de los Firmicutes, Clostridium sensu stricto 1 y Terrisporobacter fueron más abundantes en el grupo PRO/PRO en comparación con el grupo CON/CON. Ambos géneros son componentes comunes de la microbiota ileal de los cerdos63,64. Se ha observado previamente un aumento significativo de Clostridium sensu stricto 1 asociado con la edad en cerdos PW, lo que sugiere que puede estar asociado con una mayor maduración intestinal65. La diversidad α de Shannon se redujo en el íleon de los cerdos en el grupo PRO/PRO en comparación con los grupos CON/CON y PRO/CON. Un alto nivel de diversidad bacteriana a menudo se asocia con la estabilidad del ecosistema, la resistencia a la invasión de patógenos y el desarrollo del sistema inmunológico66. A pesar de estas asociaciones, a menudo se observa una reducción en la diversidad en cerdos suplementados con ZnO y se asocia regularmente con mejoras en el rendimiento del crecimiento y parámetros de salud intestinal67,68. La diversidad bacteriana reducida en el presente estudio no se asoció con ningún efecto negativo en el crecimiento o la salud de los cerdos (de hecho, fue todo lo contrario) en este estudio, como se informó anteriormente en nuestra publicación paralela13. Se ha demostrado previamente que la administración de esporas de Bacillus reduce la diversidad α de la microbiota fecal de lechones en comparación con lechones suplementados con antibióticos69. En otro estudio realizado por nuestro grupo, la diversidad α fue menor en cerdos suplementados con las mismas esporas de Bacillus que se usaron aquí durante 56 días PW en comparación con cerdos suplementados solo durante 28 días PW o con cerdos suplementados con una combinación de antibiótico y ZnO70. Esto sugiere que la duración de la suplementación es un factor importante que influye en el impacto de la suplementación con esporas de Bacillus en la diversidad bacteriana.

La abundancia del género Escherichia/Shigella fue mayor en los tres grupos suplementados con probióticos en comparación con el grupo CON/CON. Previamente, se demostró que la misma cepa probiótica reduce la E. coli patógena porcina in vitro71. La suplementación directa de esta cepa a cerdos PW también condujo a una reducción de E. coli en el íleon; sin embargo, ninguno de los aislados de E. coli poseía actividad hemolítica, lo que sugiere que eran especies comensales72. La inconsistencia de los hallazgos entre los estudios probablemente se deba a los diferentes métodos experimentales empleados, es decir, in vitro frente a in vivo y cultivo tradicional frente a secuenciación del gen 16S rRNA. Los géneros Escherichia y Shigella no se pueden distinguir usando la secuenciación del gen 16S rRNA y una búsqueda BLAST encontró que la secuencia diferencialmente abundante en el estudio actual coincide con varias cepas de E. coli, otras Escherichia spp. y algunas Shigella spp. Por lo tanto, no es posible determinar qué especie/serotipo está realmente incrementado. Aunque se ha demostrado que el género Escherichia/Shigella es más abundante en cerdos con diarrea73, esto fue en muestras rectales, no ileales y durante la lactancia, en lugar del período PW. De hecho, Escherichia/Shigella es generalmente abundante en el íleon de cerdos sanos, es decir, hasta un 23 % de abundancia en algunos estudios63 y Shigella spp. no se sabe que causen enfermedades en los cerdos74. Una de las coincidencias de secuencia principales en el estudio actual para el que se enumeró el serotipo es E. coli 0157:H7, que es un patógeno transmitido por los alimentos que causa enfermedades en los seres humanos. Si bien los cerdos pueden portar este serotipo, no se asocia comúnmente con la enfermedad en los cerdos75. El serotipo predominante de E. coli que causa PWD en cerdos es 014976 y no se identificó en la búsqueda BLAST. Además, no se observó diarrea en ninguno de los grupos de tratamiento en el presente estudio y se mejoró la altura de las vellosidades en el duodeno y el íleon de los cerdos destetados de las cerdas suplementadas con probióticos, como se informó en nuestra publicación paralela13. El rendimiento del crecimiento y la ausencia de síntomas en estos cerdos13 sugeriría que la secuencia detectada en este estudio pertenece a una especie comensal más que a una patógena. Si de hecho la secuencia representa una especie comensal, su mayor abundancia puede reducir la susceptibilidad de los cerdos suplementados con probióticos a la colonización por una cepa patógena, ya que es más probable que las cepas de la misma especie ocupen el mismo nicho ecológico que las cepas de diferentes especies77 . Sin embargo, no se puede concluir a partir de los datos actuales que las especies/cepas de Escherichia/Shigella diferencialmente abundantes no se volverían toxigénicas en las condiciones apropiadas.

La novedad de este estudio radica en que se monitorizaron los efectos de la suplementación con probióticos maternos y PS sobre la microbiota en el calostro y las heces de las cerdas, y en la digesta/heces de las crías desde el nacimiento hasta la finalización. Los datos muestran que la suplementación materna con esporas de B. altitudinis durante el final de la gestación y durante la lactancia tuvo un mayor impacto en la microbiota intestinal que la suplementación directa con PW. Estos hallazgos confirman la hipótesis de que la manipulación del microbioma en la vida temprana se puede lograr mediante la suplementación materna. La modulación del microbioma de la descendencia parece ocurrir en el presente estudio, a través de la manipulación de la composición del calostro y el microbioma del calostro, pero también puede estar relacionada con la presencia del probiótico en las heces de las cerdas, como se informó anteriormente. Las crías de cerdas suplementadas con probióticos tenían una mayor abundancia de taxones bacterianos asociados con la descomposición de carbohidratos complejos y la utilización de nutrientes en el íleon durante el período PW temprano. Esto es potencialmente un impulsor de la eficiencia alimenticia mejorada y la morfología intestinal observada durante este período, como ya se informó en una publicación paralela. El aumento de la abundancia de Lactobacillus durante el período PW tardío en las crías de cerdas suplementadas con probióticos, que no recibieron suplementos PW, puede haber contribuido al crecimiento mejorado observado en este grupo durante el período de finalización, y el aumento resultante en el peso de la canal como también. informado anteriormente. En conclusión, los hallazgos del presente estudio sugieren que la microbiota intestinal PW temprana de las crías de cerdas suplementadas con B. altitudinis se adaptaba mejor a la digestión de la dieta basada en cereales PW, lo que puede ayudar a explicar las mejoras informadas anteriormente. en la eficiencia alimenticia y el peso de la canal. Dado que los cerdos se alojaron individualmente desde el d8 PW, se requiere más investigación para dilucidar si las respuestas observadas también se verán con las prácticas comerciales de alojamiento en grupo.

Las muestras de calostro, heces e intestinos analizadas en este estudio fueron recolectadas durante un estudio previo realizado por Crespo-Piazuelo et al.13. Los materiales y métodos relacionados con el diseño experimental, el alojamiento y manejo de animales y la preparación de esporas probióticas se describen brevemente aquí con todos los detalles disponibles en la publicación de Crespo-Piazuelo et al.13.

La aprobación ética para este estudio fue otorgada por el Comité de Ética Animal de Teagasc (aprobación n.º TAEC148/2017) y el proyecto fue autorizado por la Autoridad Reguladora de Productos Sanitarios (autorización de proyecto n.º AE19132/P066). El experimento se realizó de acuerdo con la legislación irlandesa (SI n.º 543/2012) y la Directiva de la UE 2010/63/UE sobre la protección de los animales utilizados con fines científicos y de conformidad con las directrices ARRIVE.

El experimento fue diseñado como un arreglo factorial 2 × 2. Brevemente, en el día 100 de gestación, se seleccionaron 24 cerdas (Large White × Landrace) y se asignaron a uno de los 12 bloques (2 cerdas por bloque), por paridad (1 a 4 camadas anteriores), peso corporal (209 a 311 kg) y profundidad de la grasa dorsal (13,5–22 mm) y asignado al azar a: (1) una dieta estándar de control de la gestación y la lactancia (CON, n = 12) o (2) una dieta estándar de gestación y lactancia complementada con B. altitudinis WIT588 esporas (~ 4 × 109 esporas diarias desde el día 100 de gestación hasta el parto y ~ 1,2 × 1010 esporas diarias durante la lactancia durante 26 días hasta el destete de las camadas, administradas como se describe a continuación; PRO, n = 12). La crianza cruzada de lechones se realizó entre las 24 y las 48 h posparto para igualar el tamaño de la camada (14 lechones/camada) si era necesario, pero solo dentro del mismo grupo de tratamiento.

Al destete, se seleccionaron 144 lechones de estas cerdas (n = 72/tratamiento de cerdas) de todas las camadas, sobre la base del peso corporal medio de la camada (7,27 (SEM 0,168) kg) y equilibrados por género. Los lechones fueron bloqueados por tratamiento de cerda, sexo, peso corporal y camada de origen y asignados aleatoriamente a tratamientos dietéticos. Las crías de ambos tratamientos de cerdas se asignaron como parejas del mismo género a un tratamiento CON (sin probiótico) o PRO (con suplemento de probiótico) durante 28 días PW, lo que resultó en cuatro grupos de tratamiento (n = 36 lechones/tratamiento): (1) lechones destetadas de cerdas CON, alimentadas con una dieta CON (CON/CON); (2) lechones destetados de cerdas CON, alimentados con una dieta PRO (CON/PRO); (3) lechones destetados de cerdas PRO, alimentados con una dieta CON (PRO/CON); y (4) lechones destetados de cerdas PRO, alimentados con una dieta PRO (PRO/PRO). Se tomaron muestras de un subconjunto de estos cerdos como se describe a continuación. La suplementación con probióticos consistió en ~ 1 × 109 esporas de B. altitudinis WIT588 aplicadas diariamente en el alimento, como se describió anteriormente13 y como se describe a continuación. La suplementación con probióticos cesó en el día 28 PW, pero se recolectaron muestras hasta el día 118 PW (el final del período de finalización).

La composición de ingredientes y el contenido de nutrientes de todas las dietas de cerdas y crías se muestran en la Tabla complementaria S4. Crespo-Piazuelo et al.13 describen detalles sobre la formulación de la dieta y el suministro de alimento y agua.

Bacillus altitudinis WIT588 es una variante resistente a la rifampicina de B. altitudinis NCIMB 43558 (WIT572), un aislado derivado de algas marinas caracterizado tanto in vitro como in vivo como probiótico para cerdos, que se utilizó para facilitar la enumeración en el TGI porcino13,71,72 ,78. La cepa se denominó primero Bacillus pumilus sobre la base de la secuenciación de los genes gyrB y pyrE72, pero desde entonces se ha identificado como B. altitudinis sobre la base de la secuenciación del genoma completo (datos no publicados). Las esporas de B. altitudinis WIT588 se prepararon según lo descrito previamente por Prieto et al.72, se suspendieron en agua estéril, se dividieron en alícuotas y se almacenaron a -20 °C hasta su uso. En la mañana de la administración, las suspensiones de esporas descongeladas se diluyeron en agua destilada a la dosis requerida y se agregaron al alimento como se describe por Crespo-Piazuelo et al.13.

El alojamiento y manejo de cerdas y crías se describe en detalle por Crespo-Piazuelo et al.13. Brevemente, las cerdas PRO se alojaron separadas de las cerdas CON para minimizar la contaminación cruzada. Los corrales de parto (2,5 m × 1,8 m) tenían una jaula de parto sobre un suelo parcialmente enrejado con una almohadilla térmica para los lechones. La temperatura de las salas de parto se controló automáticamente y se mantuvo a ~ 24 °C al parto y se redujo gradualmente a 21 °C al día 7 de lactación. Al destete, los lechones se alojaron en parejas del mismo sexo en 72 corrales (n = 2 cerdos/corral) en 4 habitaciones, con tratamientos distribuidos por igual en todas las habitaciones. Los corrales (1,2 m × 0,9 m) estaban completamente enrejados con piso de plástico (Faroex, Manitoba, Canadá). Se dejaron corrales vacíos entre tratamientos para evitar la contaminación cruzada de probióticos. El día 8 PW, se sacrificaron 40 cerdos (n = 10/tratamiento) mediante aturdimiento con perno cautivo seguido de exsanguinación para facilitar el muestreo de la digesta. Al mismo tiempo, se retiró de la prueba un cerdo de cada uno de los corrales restantes (32 corrales) y los lechones restantes (n = 72) se encerraron individualmente hasta el día 55 PW. La temperatura de las salas de destete se mantuvo a 28 °C durante los primeros 7 días PW, se redujo gradualmente a 22 °C el día 28 PW y se mantuvo a 22 °C hasta el día 56 PW. En d56 PW, los cerdos se trasladaron a una de las cuatro salas de finalización, donde se encerraron individualmente en corrales completamente enrejados (1,81 m × 1,18 m) hasta el final del período experimental (d118 PW). La temperatura del aire se mantuvo entre 20 y 22 °C.

Durante el muestreo de cerdas y crías, se tomaron estrictas medidas de higiene para evitar la contaminación cruzada entre tratamientos de la siguiente manera. Primero se manejaron los cerdos que no recibieron probióticos, seguidos por los grupos de tratamiento con probióticos. Los guantes se cambiaron entre cerdos y todo el personal usó overoles nuevos desechables que se cambiaron antes de comenzar el muestreo de cada grupo de tratamiento. Todo el equipo utilizado se desinfectó minuciosamente con Virkon® al 1 % después de su uso para evitar la contaminación cruzada en los muestreos posteriores.

Las muestras de calostro (n = 12 cerdas/tratamiento) se recolectaron mediante ordeño manual de los primeros cuatro pezones inmediatamente distales a la cabeza de la cerda en un lado de la ubre dentro de las 4 h posteriores al parto. Se usó yodo para limpiar a fondo el área que rodea los pezones antes de la recolección de la muestra y se descartó el primer ml de calostro. Las muestras (2 × 4,5 ml en tubos estériles) se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 °C hasta su análisis.

Se recolectaron muestras fecales de cerdas (n = 24) directamente del recto mediante estimulación digital suave el día 100 de gestación, al parto, el día 13 de lactancia y al destete de las camadas (~ día 26 de lactancia). Antes del destete, se tomaron hisopos rectales de las crías el ~ día 13 de lactancia (n = 12 repeticiones de cerdo por tratamiento) utilizando hisopos estériles con punta de viscosa (Sarstedt Ltd, Drinagh, Wexford, Irlanda), las muestras fecales se obtuvieron mediante estimulación rectal digital al destete. , d13 PW, d28 PW y d56 PW de los mismos cerdos (n = 10 repeticiones de cerdo por tratamiento) y se recolectaron muestras de heces recién evacuadas en d118 PW (n = 5 para CON/CON, n = 4 para CON/PRO, n = 4 para PRO/CON y n = 6 para PRO/PRO, respectivamente). Los hisopos rectales se colocaron en hielo antes del almacenamiento a -80 °C y las muestras fecales se recogieron en tubos estériles y se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 °C hasta el análisis.

Cuarenta lechones (n = 10 cerdos por tratamiento), fueron sacrificados humanitariamente en d8 PW mediante aturdimiento con perno cautivo seguido de exanguinación y se eliminó inmediatamente todo el tracto intestinal. Las muestras de digesta del íleon (15 cm proximal a la unión ileocecal), el ciego (punta terminal) y el recto se recogieron asépticamente en tubos estériles, se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 °C hasta su análisis.

El ADN total se extrajo de hisopos rectales y muestras fecales y de digesta utilizando el minikit de heces de ADN QIAamp (Qiagen, Crawley, Reino Unido) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, además de agregar un paso de batido de perlas y aumentar la temperatura de lisis a 95 °C, para aumentar el rendimiento de ADN79. El volumen de tampón ATE también se redujo de 200 a 30 µl y se dejó reposar en la membrana del filtro de la columna giratoria durante 5 min antes de la centrifugación (ambos para maximizar la concentración de ADN). Para la extracción de hisopos rectales, se añadió 1 ml de solución salina tamponada con fosfato estéril a cada hisopo y se agitó con vórtex durante 2 min. A continuación, el líquido resultante se transfirió a un tubo estéril de 1,5 ml y se centrifugó durante 2 min a 14.000 rpm. El sobrenadante se descartó y el precipitado restante se utilizó para la extracción de ADN. Para las muestras de materia fecal y digesta, se utilizaron 0,25 g de cada muestra para las extracciones.

El ADN total se extrajo de las muestras de calostro utilizando el kit microbiano DNeasy PowerFood (Qiagen). Se siguieron las instrucciones del fabricante con algunas modificaciones como sigue: (1) Se omitió el paso de homogeneización inicial; (2) se agregaron 1,8 ml de calostro al tubo de recolección de 2 ml por triplicado para procesar 5,4 ml de calostro en total; (3) la duración del primer paso de centrifugación se aumentó a 15 min para maximizar la formación de gránulos; (4) las células resuspendidas se añadieron a un tubo con tapón de rosca que contenía perlas de zirconio esterilizadas en autoclave (0,125 g de 0,1 mm y 0,125 g de 1,0 mm, una sola perla de 2,5 mm; Stratech Scientific, Ely, Reino Unido) y se batieron las perlas. se realizó en lugar de agitar en vórtice en tubos PowerBead durante 3 min seguidos de 1 min de descanso y luego durante 2 min seguidos de 1 min de descanso, para evitar el corte del ADN; (5) en el paso final, el volumen del tampón de elución se redujo de 100 a 20 µl y se dejó reposar en la membrana del filtro de la columna giratoria durante 5 min antes de la centrifugación para maximizar la concentración de ADN.

El perfil microbiano se realizó mediante secuenciación de alto rendimiento de la región V3-V4 del gen 16S rRNA (lecturas de extremos emparejados de 2 × 300 pb) después de 600 ciclos de amplificación en una plataforma Illumina MiSeq. Se siguió el protocolo de preparación de la biblioteca metagenómica 16S (Nextera) recomendado por Illumina. Se evaluó la calidad de las lecturas emparejadas en todas las muestras mediante FastQC (v0.11.7)80 y se recortó la calidad (cuttoff-phred = 20) mediante BBduk de la suite BBTools (https://jgi.doe.gov/data-and-tools /bbherramientas/). En este paso también se eliminaron los cebadores y las colas de lectura de baja calidad. La canalización DADA281 se utilizó para realizar filtrado de lectura y desreplicación, detección y eliminación de quimeras, fusión de pares de lectura e inferencia de variantes de secuencia de amplicón (ASV) en cada muestra. La taxonomía se asignó a cada ASV derivado utilizando un método clasificador bayesiano ingenuo contra la base de datos SILVA (Versión 128)82. Se identificó la clasificación a nivel de especie, cuando fue posible utilizando la asignación taxonómica para coincidencias de secuencias exactas con la base de datos SILVA o comparando las secuencias con la base de datos de nucleótidos del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) de EE. UU. (disponible en: https://blast.ncbi) .nlm.nih.gov/Blast.cgi). Los análisis del índice de diversidad alfa (Shannon) y la diversidad β (UniFrac) se calcularon utilizando el paquete phyloseq83 en la versión R 4.0284. Se realizaron gráficos nMDS y MDS basados ​​en la matriz de distancia UniFrac y posteriormente se trazaron utilizando el paquete ggplot285 en R versión 4.0284.

Los perfiles de ácidos grasos de cadena corta de la digesta ileal fueron determinados por Alimetrics Diagnostics (Espoo, Finlandia) usando cromatografía de gases (GC; Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EE. UU.) con ácido piválico (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU. ) utilizado como patrón interno. El procedimiento de cromatografía usó una columna de vidrio rellena con 80/120 Carbopack B-DA/4% Carbowax fase estacionaria, helio como gas portador y un detector de ionización de llama (FID) y ha sido descrito previamente por Apajalahti et al.86. El ácido láctico y los AGV (ácido acético, ácido propiónico, ácido isobutírico, ácido butírico, ácido 2-metilbutírico, ácido isovalérico y ácido valérico) se derivatizaron a los respectivos ésteres de fenilo utilizando reactivo de cloroformiato de fenilo. Los ésteres resultantes fueron analizados por Agilent GC-FID (Agilent Technologies). En la cuantificación se utilizó una calibración estándar interna emparejada con matriz con ácidos butírico-d7- y acético-d3.

El análisis estadístico de la abundancia de OTU se realizó utilizando DeSeq287 en R versión 4.0284. Los ASV de baja abundancia se filtraron manualmente y los ASV se conservaron si la suma de las lecturas de ese ASV en todas las muestras era superior al 0,005 % de todos los ASV. Una tasa de descubrimiento falso de <0,05 fue indicativa de una diferencia de abundancia significativa entre los grupos. Para cada taxón, las diferencias entre las abundancias medianas de las muestras en cada grupo de tratamiento se evaluaron utilizando la prueba Wilcoxon Rank Sum del paquete R Metacoder88. Las matrices de distancia UniFrac ponderadas se sometieron a ANOVA permutacional para probar los efectos significativos de los tratamientos en la estructura de la comunidad microbiana en muestras en varios puntos de tiempo. Los resultados de todos los análisis se presentan utilizando valores de P ajustados.

Para el análisis estadístico de los resultados de SCFA ileal, los datos primero se investigaron utilizando las pruebas de Shapiro-Wilk y Kolmogorov-Smirnov dentro del procedimiento UNIVARIATE de SAS 9.4 (SAS Institute Inc., Cary, NC). Como los datos no se distribuyeron normalmente, se analizaron más utilizando el procedimiento GLIMMIX de SAS con la función de enlace de registro y una distribución gamma. La función ilink se utilizó para volver a transformar los datos a la escala original. El modelo incluyó los efectos del tratamiento materno y PW como efectos fijos y su interacción asociada. El cerdo individual fue la unidad experimental. Las medias de mínimos cuadrados se compararon entre los grupos de tratamiento usando la prueba t y los valores de P se corrigieron para comparaciones múltiples usando el ajuste de Tukey. Se utilizó el método de Satterthwaite para estimar los grados de libertad. Los datos se presentan en el texto y las tablas como medias de mínimos cuadrados con los errores estándar combinados de la media. El nivel de probabilidad que denotó significación fue P ≤ 0,05, mientras que 0,05 < P < 0,10 se consideró una tendencia numérica.

Los datos de secuenciación sin procesar generados por este estudio se depositaron en el archivo de lectura de secuencias (SRA) de NCBI con el número de acceso de BioProject PRJNA878669.

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Agradecemos al personal de la granja en el Departamento de Desarrollo de Cerdos en Teagasc Moorepark por su ayuda con el estudio de cerdos. El proyecto que condujo a estos resultados fue cofinanciado por Enterprise Ireland (No. CF20150361) y el Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER) en el marco del Programa de Fondos Estructurales y de Inversión Europeos de Irlanda 2014-2020. GEG y RR también recibieron fondos a través de una extensión con costo COVID-19 de la Autoridad de Educación Superior.

Centro de Investigación de Eco-Innovación, Departamento de Ciencias, Campus de Waterford, Universidad Tecnológica del Sureste, Waterford, Irlanda

Ruth Rattigan, James Cullen, John P. Phelan y Gillian E. Gardiner

Departamento de Desarrollo Porcino, Centro de Innovación e Investigación de Animales y Pastizales, Teagasc, Moorepark, Fermoy, Co. corcho, irlanda

Peadar G. Lawlor, Daniel Crespo-Piazuelo y Samir Ranjitkar

Centro de Innovación e Investigación de Animales y Pastizales, Teagasc, Grange, Dunsany, Co. Meath, Irlanda

Pablo Cormian

APC Microbiome Ireland, University College Cork, Cork, Irlanda

Fiona Crispie

Centro de Investigación de Alimentos, Teagasc, Moorepark, Fermoy, Co. corcho, irlanda

Fiona Crispie

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GEG y PGL concibieron el estudio y, junto con SR, diseñaron el experimento. PGL y GEG dirigieron el estudio. SR y PGL realizaron el experimento con animales. FC, JPP y JC realizaron análisis de laboratorio. RR analizó estadísticamente los datos VFA. PC realizó los análisis bioinformáticos y analizó estadísticamente los datos de la microbiota. RR, PGL, DC-P., PC y GEG interpretaron los datos. RR, PGL y GEG redactaron el manuscrito. RR, PGL y GEG revisaron el manuscrito. Todos los autores leyeron y aprobaron la versión final del manuscrito.

Correspondencia a Gillian E. Gardiner.

Gillian Gardiner y Peadar Lawlor tienen pendiente una patente "Una cepa aislada de Bacillus altitudinis y su uso como probiótico". Los demás autores declaran no tener intereses contrapuestos.

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Reimpresiones y permisos

Rattigan, R., Lawlor, PG, Cormican, P. et al. La suplementación materna y/o post-destete con esporas de Bacillus altitudinis modula la composición microbiana del calostro, digesta y heces en cerdos. Informe científico 13, 8900 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-33175-2

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Recibido: 17 Agosto 2022

Aceptado: 08 abril 2023

Publicado: 01 junio 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-33175-2

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